吴禄贞生于一个知识分子家庭，家有薄田10亩，父亲为私塾老师。少年时，吴禄贞就读于父亲在武昌的梦泽书屋，他擅长诗文，对西学充满兴趣，性格豪爽，少有大志，8岁时，曾写下对联：“一拳打倒亚细亚，两脚踢翻欧罗巴”。
1895年父吴利彬去世，其被迫到湖北织布局当童工。后因为女工抱不平，痛打工头而离开。1896年怀着为国雪耻的志愿，入湖北新军工程营当兵，后又考入湖北武备学堂。与孙武、傅慈祥等志同道合的爱国青年成为挚友。他的《投笔从戎争先赴》令张之洞十分赞赏有加，被大量油印，在新军军营和武备学堂内广为散发。
1898年，被张之洞推荐入日本士官学校学习陆军骑兵科深造，成为我国留日第一期士官生。在校结识了张绍曾、蓝天蔚，三人学习成绩突出，志趣不凡，后来被人们称为“士官三杰”。他看到明治维新后的日本在战败中国之后飞速发展，大为震惊，痛感非改革政治、倾覆清室，不能转弱为强。决心以革命排满为己任，走上革命道路。留日期间，吴禄贞除了刻苦学习军事知识，对于西方民主思想也多有参研，并发起组织了留日学生的第一个爱国团体“励志会”。后吴禄贞在横滨拜访了孙中山，被孙中山的革命思想所吸引，加入兴中会。
1900年，义和团运动爆发。孙中山决定在珠江、长江流域乘势起义，派吴禄贞、傅慈祥秘密回国，与唐才常共同谋划。吴禄贞和秦力山指挥的自立军前军为庚子年长江流域大举中唯一发难者。自立军起义失败后，吴禄贞重返日本。
1901年冬，吴禄贞从士官学校毕业，回到武昌后，被张之洞扣押。在审讯时，张之洞反被吴禄贞说服，委他以重任，任武昌武普通学堂教习、会办，一时轰动武汉。吴禄贞利用职务之便并继续从事革命活动，广泛撒播革命火种，秘密翻印陈天华的《警世钟》、《猛回头》等革命书刊，散发到学堂、军队。创建了国内第一个秘密组织“花园山聚会”，倡导“秀才当兵”，使得一批具有新思想的知识分子从军，大大加强了军队本身的文化程度。
1903年，吴禄贞应黄兴邀请，同李书城、耿觐光等人前往长沙与黄兴、宋教仁、陈天华等在湖南发起组织华兴会，积极协助黄兴制订在长沙起义的计划，筹划湖南独立。恰逢此时，清廷在北京设立练兵处编练新军，急需用人，吴禄贞被在日本士官学校的好友良弼举荐获准。黄兴劝他“投身中央，伺隙而动”，吴遂北上就职。1904年5月奉调入京，任练兵处军学司训练科马队监督。在京期间，仍与湖北志士暗中联系。刘静庵被捕后，他曾竭力援救。
1906年赴新疆伊犁考察新军。因忤陕甘总督升允，被撤去监督差使，被扣留于兰州。
1907年7月，徐世昌任东三省总督，吴禄贞随行任军事参议。此时，日本制造舆论，妄图以吞并中国“间岛”地区。吴禄贞提出“筹边之道，贵在知边”，为徐世昌所接纳，被派往延吉调查边务，任延吉边务帮办。8月，吴禄贞得到日人已在间岛附近集结的消息，立即召开会议，与当地民团首领韩登举取得联系。经过妥善布置，吴禄贞向日人头目斋藤季治致信，要求交涉。交涉当日，韩登举率队伍远远布阵，斋藤以为中方早有准备，心中忐忑，不得不引手下撤出中国边境，叹曰：“中国尚有人在，如吴禄贞者，不可欺也。”之后，吴禄贞在徐世昌支持下主持编写了《延吉边务报告书》，并绘有《延吉边务图》。后来中方以此为谈判的重要依据，终于让日军彻底退出了间岛地区。
1908年11月，吴禄贞回京不久，日人又开始制造纠纷，清廷再次调吴禄贞前往延吉。1909年5月升延吉边务督办，并任陆军协都统。1909年9月4日，《图们江中韩界务条款》在京签订，坚持了中韩以图们江为界河的历史事实，吴禄贞因间岛功绩，被誉为“间岛英雄”!
光绪、慈禧相继亡故后，摄政王载沣企图削弱袁世凯军权，故于1910年调吴禄贞入京，孙中山、黄兴对此相当重视，李书城也建议吴禄贞争取外放，以便更好进行革命工作。吴禄贞用同盟会提供的巨款活动奕劻成功，谋得驻扎保定的新军第六镇统制之职。新军第六镇是袁世凯的嫡系部队，原统制为段祺瑞，军中大小官员皆是袁世凯亲信，对于吴禄贞的上任充满了敌视。
1911年，武昌起义爆发，陆军大臣荫昌调第六镇李纯所部南下，吴禄贞请求随军南下却被清廷拒绝。这时，屯兵滦州的张绍曾举行兵谏，要求双方停战、清政府实行立宪。清政府派吴禄贞前往平息，吴禄贞到了滦州后却鼓动张绍曾起义，策应武昌起义，颠覆清王朝，张绍曾犹豫不决。
武昌起义后，赴滦州约张绍曾等举兵反清，又赴石家庄与山西革命党联系，拟联合北方新军直捣北京。后由奸细告密未成。他断然截留北洋军运往湖北的军火，并电奏清廷，要求停止进攻汉口。清廷怀疑其为革命党，但又不敢贸然将其撤换，特授予署理山西巡抚以笼络。
随即山西也爆发了革命，阎锡山被推为山西革命军都督，清廷调吴禄贞率第六镇前往镇压。吴禄贞却在娘子关与阎锡山会谈，组建“燕晋联军”，商定于11月7日共讨北京。11月2日，吴禄贞向清廷谎称山西民军已接受招安，并以“消弭战争”为由在石家庄扣留了北洋军运往湖北的军火，吴禄贞的举动令清廷产生了怀疑。袁世凯指使其死党周符麟用二万元收买了吴部下马步周和其他几个军官。11月7日凌晨，马步周率几名打手闯进吴的住所将其枪杀，然后又割下吴禄贞的首级，以便向主子请功。吴禄贞就这样被袁世凯秘密买凶杀死，年仅31岁。
民国成立后，孙中山特颁第一号抚恤令，谥吴禄贞为大将军，于1912年3月14日在上海张园召开吴禄贞追悼会，亲笔写下悼词“盖世之杰”以缅怀这位壮志未酬的青年才俊。孙中山在祭文中写道：“代有伟人，振我汉声。觥觥吴公，盖世之杰，雄图不展，捐躯殉国……”，
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