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于定国，字曼倩，东海郡郯县人。
他的父亲于公曾任县狱史、郡决曹等官职，于公在狱史一职时，东海郡有一个妇女年纪轻轻就守了寡，没有孩子，对婆婆很是孝顺，婆婆心疼她让她改嫁却被她拒绝，后来老太太为了不再拖累媳妇竟自缢身亡，但婆婆的女儿却将寡妇告上了官府说是她害死了自己的母亲，寡妇被抓后申辩未果，被屈打成招。于公看了案卷后觉得这个寡妇不是杀害婆婆的凶手，但太守却不同意于公的看法没有释放寡妇，于公见说服不了太守抱着卷宗在郡府大哭起来，之后又辞去官职，不久后寡妇被处死。寡妇死后，郡中大旱了三年。后来新太守上任后在于公的帮助下替寡妇洗清了冤屈。这件事情过后，于公也深受当地百姓的爱戴，后来郡中的老百姓为他立了生祠，称作于公祠。
于定国从小也耳濡目染，从小跟着父亲学习律法，治狱严谨。他任过狱史、郡决曹等官职，之后补廷尉史，并被推选与御史中丞从事办理谋反者的狱案，在一次事件中他才智出众断案精准升为侍御史，又升任御史中丞。御史中丞是古代御史台的高官,仅次于御史大夫,相当于现在的国家检察长的官职。元平元年，刘贺接受皇帝玺绶，承袭皇帝的尊号，继位之后的刘贺不仅行狂乱之事，还把自己的从昌邑封地带来人全部安插到朝廷重要部队。包括给刘贺亲下玺书的太后，刘贺对太后居住的长乐宫进行更换守卫。很多大臣都敢怒不敢言，于定国冒死上书规谏，力陈刘贺的荒唐行径。大将军霍光毅然决然地将他废掉，拥立刘询为帝，这就是后来被称为中兴之主的汉宣帝。
汉宣帝刘询即位后大将军霍光兼任尚书事，在霍光的举荐下于定国破格升为光禄大夫，备受重用，几年后又任命为廷尉。廷尉位列九卿，为中央最高司法审判机构长官，汇总全国断狱数，主管诏狱和修订律令的有关事宜。在于定国担任廷尉的十多年中，他始终一视同仁，十分审慎地处理，不畏强权，为实现“天下无冤”进行了不懈的努力，赢得了朝廷上下的称赞。
汉宣帝甘露二年，于定国任御史大夫，位列三公。汉元帝即位后，关东连年遭受灾害，百姓流离失所，有人进言应把责任推到大臣身上，于定国作为丞相上书请罪主动承担了执法不力的责任，正好乘着这股东风，更加加大了执法力度。使得当时的社会环境大有好转。永光元年，于定国托病辞官回乡，元帝便赐给他四匹马拉的可以坐乘的车、黄金六十斤，罢官归家。最后于定国逝世时年享七十多岁，谥号安侯。
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