井伊直虎是远江井伊谷城主(国人)井伊直盛的女儿，母为新野亲矩之妹祐椿尼。幼名不明，出生年份不明，推测天文5年(1536年)前后诞生。
早年出家
天文11年(1542年)，井伊直虎的祖父井伊直宗因为今川义元的命令参与三河国田原城的攻城战而战死。父亲井伊直盛因为没有儿子，打算将其堂弟井伊直亲(直盛的叔父井伊直满的儿子)作为自己的婿养子。
天文13年(1544年)，因为井伊氏的家老小野道高(政直)的谗言，井伊直亲的父亲井伊直满及其弟弟井伊直义被怀疑要向今川义元谋反而被迫自杀，直亲也因此逃亡到信浓国。在井伊直亲逃亡期间，井伊直虎(此前幼名不明)出家为尼，取名为次郎法师。
弘治元年(1555年)，井伊直亲在道高死后一年才回到今川家，但在信浓的期间，娶了奥山亲朝(另一说是奥山朝利)之女为正室，因此只能解除与次郎法师的婚约。
永禄3年(1560年)5月，井伊直盛在桶狭间之战中战死。
永禄5年(1562年)，井伊直亲继承家督，但又因为小野道好(道高之子)谗言被今川氏真赐死。井伊一族曾因此受到连累，在舅父新野亲矩(次郎法师母亲祐椿尼的兄长)的拥护下而获救。
永禄6年(1563年)，曾祖父井伊直平在进攻天野氏的犬居城的途中去世。依据《井伊直平公御一代记》的记载(详见井伊家传记)，是因为喝了曳马城(1570年德川家康入城后改名为滨松城)城主饭尾连龙妻子田鹤方(椿姬)的毒茶而死亡(远州惣剧)。
永禄7年(1564年)，因今川氏声势衰退不止，引发饭尾连龙等人叛乱，新野亲矩及直盛的重臣中野直由代表今川一方讨伐曳马城(引间城)而被杀死。身为龙潭寺住持的叔父南溪瑞闻获悉后，将直亲的幼子虎松(后来的井伊直政)移送到凤来寺。
继任家主
永禄8年(1565年)，由于家中没有男丁，次郎法师还俗，并以井伊直虎的男儿之名继承井伊家督之位。
永禄11年(1568年)，小野道好进攻井伊谷城。同年，由于小野专横，井伊谷三人众(近藤康用、铃木重时、菅沼忠久)寻求德川家康帮助。12月15日德川家康远州侵攻，在家康协助下井伊直虎得回实权，小野道好开始逃亡。然后井伊氏为了复仇而攻入引间城(在丈夫死后，成为城主的田鹤方因此自杀)。
元龟元年(1570年)，德川家康追究小野道好陷害直亲之事，处死被捕的小野道好。
元龟3年(1572年)秋，武田信玄部将山县昌景攻略井伊谷城，井伊直虎在井平城防卫战败退后逃亡浜松城。之后滨松城的织田·德川联合军在三方原合战及隔年的野田城之战遭到武田军的溃败。
元龟4年(1573年)4月，武田信玄病倒，武田军撤退，井伊直虎夺回井伊谷城。
在井伊直虎担任城主的期间(1565年起)，收直亲的遗儿虎松(井伊直政)为养子。
天正3年(1575年)，15岁的井伊直政以三百石出仕德川氏。
天正10年8月26日(1582年9月12日)井伊直虎病逝，家督由21岁的井伊直政继承。葬于井伊家的龙潭寺，与直亲合墓。
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